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弗吉尼亞大學發現全新Myh11-CreERT2-RAD小鼠可作為平滑肌細胞研究的新工具

新聞來源：CEIDI西遞發布時間：2024-03-19

平滑肌細胞(SMC, Smooth Muscle Cell)組成了血管和內臟器官的肌肉層，在損傷、炎癥或高膽固醇血癥的情況下，血管SMC可以“去分化”和增殖，若不加以控制，會導致血管內膜增生、動脈粥樣硬化及其他病變。由于去分化的SMC會嚴重下調特異性收縮蛋白的表達，因此在譜系追蹤方法出現之前，SMC在心血管疾病中的作用一直被低估。人們利用Cre-loxP重組系統對成熟的SMC進行標記后，發現分化的SMC可產生多種細胞，類似巨噬細胞、成纖維細胞和脂肪細胞。這些結果從根本上改變了SMC的研究。>>>商務洽談，點此處，在線咨詢

Myh11-CreERT2-Off小鼠品系被認為是SMC研究中的金標準，目前已廣泛用于條件突變或譜系追蹤實驗。這個品系在血管和內臟SMC中發生特異性重組，表明編碼平滑肌肌球蛋白重鏈的MYH11仍是分化SMC的最具特異性標志物。不過，遺憾的是，這種基于細菌人工染色體(BAC, bacterial artificial chromosome)的小鼠品系插入位置位于Y染色體中，因此無法對雌性小鼠進行分析。為此，弗吉尼亞大學醫學院等機構的研究人員構建了一種新的小鼠品系Myh11-CreERT2-RAD。他們在小鼠的2號染色體上插入BAC，因此可以在雄性和雌性小鼠上開展譜系追蹤和基因敲除研究。這項成果發表在《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》雜志上。

弗吉尼亞大學發現全新Myh11-CreERT2-RAD小鼠可作為平滑肌細胞研究的新工具

圖片來源：《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》

(https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/ATVBAHA.122.318160)

研究材料與方法

在這項研究中，研究人員對BAC克隆RP23-151J22進行改造，在Myh11基因的起始密碼子后插入Cre-ERT2表達框，產生了Myh11-CreERT2-RAD轉基因小鼠品系(由賽業生物提供)。他們將Myh11-CreERT2-RAD小鼠與兩種不同的熒光報告基因小鼠雜交，并通過流式細胞術和免疫熒光分析檢測了SMC的特異性標記。

技術路線

01 對細菌人工染色體進行改造，構建Myh11-CreERT2-RAD小鼠

02 通過報告基因表達比較Myh11-CreERT2-RAD與Myh11-CreERT2-Off的活性

03 評估Myh11-CreERT2-RAD轉基因驅動的Cre表達是否具有SMC特異性

04 評估Myh11-CreERT2-RAD小鼠在缺乏tamoxifen下的報告基因表達

研究結果

1 構建Myh11-CreERT2-RAD小鼠

研究人員首先對BAC克隆進行改造，在小鼠Myh11基因的起始密碼子后插入Cre-ERT2表達框，并去除BAC載體骨架上的loxP和loxP511位點。之后將改造后的BAC注射到C57BL/6小鼠受精卵的原核中，使其隨機插入基因組。然后將受精卵植入代孕母親體內，獲得攜帶轉基因的后代。Myh11-CreERT2-RAD小鼠的構建工作由賽業生物完成。為了確定Myh11-CreERT2-RAD轉基因的染色體插入位點，他們進行了靶向位點擴增分析和新一代測序，顯示轉基因整合在2號染色體上。

2 與Myh11-CreERT2-Off小鼠的比較

為了比較Myh11-CreERT2-RAD與Myh11-CreERT2-Off的活性，研究人員將小鼠與tdTom或eYFP熒光報告基因小鼠雜交，并在小鼠口服tamoxifen后通過共聚焦顯微鏡或流式細胞術評估熒光蛋白表達(圖1)。他們發現，口服tamoxifen可以誘導Cre+小鼠頭臂動脈的SMC表達tdTom或eYFP。細胞計數顯示，頭臂動脈中95%的SMC表達tdTom。

通過熒光蛋白分析，研究人員發現Myh11-CreERT2-RAD和Myh11-CreERT2-Off小鼠的報告基因表達差異小于10%。重要的是，管腔內的內皮細胞或外彈力板的外膜細胞沒有檢測到標志物。按性別來看，雄性和雌性Myh11-CreERT2-RAD小鼠的報告基因表達無顯著差異。這些結果表明，Myh11-CreERT2-RAD轉基因驅動了動脈中SMC的報告基因重組，并且與雄性Myh11-CreERT2-Off小鼠相當。

Myh11-CreERT2-RAD有效誘導了floxed tdTom報告基因重組[1]

3 熒光蛋白表達具有SMC特異性

為了確定Myh11-CreERT2-RAD轉基因驅動的Cre表達是否具有SMC特異性，研究人員通過免疫熒光共聚焦顯微鏡檢查了各種組織中的tdTom表達。他們在心臟的冠狀血管中觀察到tdTom表達，并在肺動脈和肺周細胞以及視網膜和斜方肌的小血管和周細胞中檢測到tdTom表達。通過這些數據，他們認為Myh11-CreERT2-RAD轉基因在血管和內臟SMC及周細胞中驅動Cre重組的方式與Myh11-CreERT2-Off類似。

4 轉基因小鼠表現出不依賴tamoxifen的報告基因重組

之前有報道稱，許多CreERT2小鼠品系表現出不依賴tamoxifen的重組。為了確定Myh11-CreERT2-RAD或Myh11-CreERT2-Off小鼠是否會出現這種情況，研究人員檢測了未口服tamoxifen的轉基因小鼠中的tdTom或eYFP表達。他們發現，在缺乏tamoxifen的情況下，兩種轉基因小鼠均零星表達了tdTom，但eYFP表達未檢測到(圖2)。

他們推測，tdTom報告基因的重組閾值較低，因此與包括eYFP在內的其他報告基因相比，特別容易受到CreERT2本底重組的影響。后續分析發現，這種重組是SMC特異性的，只有在Myh11-CreERT2-RAD或Myh11-CreERT2-Off轉基因存在時才會發生，原因可能是一部分的CreERT2蛋白在沒有tamoxifen的情況下被轉運到了細胞核。這種滲漏取決于floxed基因的重組閾值，需要對每個基因進行嚴格評估。

Myh11-CreERT2-RAD和Myh11-CreERT2-Off可誘導不依賴tamoxifen的報告基因重組[1]

研究結論

總的來說，這項研究構建并驗證了一種新的常染色體Myh11 Cre驅動的小鼠Myh11-CreERT2-RAD。它的性能與Myh11-CreERT2-Off小鼠類似，但優點是可以同時研究雄性和雌性小鼠。這種小鼠品系是一種有價值的新工具，有助于發現健康和疾病狀態下SMC功能的性別差異。

原文檢索：[1]Deaton RA, Bulut G, Serbulea V, et al. A New Autosomal Myh11-CreERT2 Smooth Muscle Cell Lineage Tracing and Gene Knockout Mouse Model-Brief Report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023 Feb;43(2):203-211. doi: 10.1161/ATVBAHA.122.318160.

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